Fluoroscense

FLUOROSCENSMIKROSKOPI

- EN TEKNISK FORKLARING

 

Fluorescensmikroskopi er en særlig mikroskopiteknik, hvor man anvender specielle fluorescerende molekyler til at mærke enten celleorganeller eller cellemembraner til at visualiserer cellen med. Derudover findes der naturligt fluorescerende molekyler inde i celler, som også kan anvendes til at visualiserer cellen med. Fluorescens er et optisk fænomen der opstår, når man belyser et fluorescerende materiale med en bestemt bølgelængde, som bliver absorberet, der efterfølgende udstråler lys med en bølgelængde der er længere, end den der blev anvendt til at bestråle prøven med. Fluorescens processen er illustreret herunder med et energi diagram, der viser, hvorledes fluorescens opstår. Fluorescensprocessen starter ved, at en fluorofor i sin grundtilstand bliver exciteret af en foton, som har en energi svarende til energiforskellen mellem grundtilstanden og den højeste exciterede tilstand i det næste energiniveau. Det er dog ikke favorabelt for fluoroforen at forblive i den exciterede tilstand. For at fluoroforen kan vende tilbage til grundtilstanden igen, skal den overskydende energi omsættes. Dette kan ske ved at bindinger i molekylet brydes eller ved varmeafgivelse. Den hyppigste måde derimod er ved at udsende en foton svarende til energiforskellen mellem den laveste exciterede tilstand og grundtilstanden. Fotonen der udsendes mister derved energi i forhold til den absorberede foton, hvorved den får en længere bølgelængde. Fluoroforer er specielt designet til at denne energiforskel svarer til en bølgelængde i det synlige spektrum der ligger omkring 380-750 nm, hvorved den udsendte foton er synlig for det menneskelige øje.

En skematisk repræsentation af et energi diagram (Jablonski diagram), der illustrerer hvorledes fluoroscens opstår. De farvede cirkler viser energitilstanden i fluoroforen, hvor grøn er det normale energi niveau og rød er det maksimale energi niveau.

Fordi fluoroforer er specielt designet til at udsende en bestemt bølgelængde, når de fluorescerer kræver et fluorescensmikroskop en lyskilde der er i stand til at frembringe et bredt spektrum af forskellige bølgelængder.

En simpel illustration der viser de vigtigste dele af et fluoroscensmikroskop.

En meget anvendt lyskilde er f.eks. en Xenon arc lampe eller en kviksølvslampe, der begge ustråler hvidt lys, hvilket består af alle synlige bølgelængder. For at frembringe en bestemt bølgelængde bruges et specielt optisk filter kaldet et excitations filter til at udvælge denne, og filtrerer de øvrige bølgelængder fra. Den udvalgte bølgelængde passerer dernæst fra excitationsfiltret til et specielt optisk element kaldet for et dikroisk spejl. Dette specielle spejl er i stand til at reflekter visse bølgelængder, mens det lader andre passere igennem. Det filtrerede lys fra excitationsfiltret bliver reflekteret af det dikroiske spejl ned på prøven. Her bliver lyset absorberet af fluoroforerne i prøven, der udsender fotoner med en længere bølgelængde. Fordi de udsendte fotoner har en længere bølgelængde er de I stand til at passerer det dikroiske spejl, og foresætte til emmisionsfiltret, der fjerner bølgelængder med en uønsket bølgelængde, inden de når detektoren.

Fluoroforer

Der findes et bredt udvalg af fluorescerende molekyler (fluoroforer), der udsender lys med enhver tænkelig synlig bølgelængde. De fleste fluoroforer er organiske molekyler der indeholder enten aromatiske ringe eller dobbelt / tripel bindinger. Disse er kan være forbundet til andre molekyler såsom lipider, proteiner, antistoffer m.fl. der gør dem i stand til at binde sig til bestemte miljøer i cellen. En fluorofor der er bundet til et lipid ville f.eks. akkumuleres i diverse membraner i cellen. Et lille udvalg af lipid fluoroforer anvendt af forskerne på MEMPHYS er vist herunder.

Et lille udvalg af hyppigt anvendte fluoroforer til at mærke f.eks. DNA (DAPI), celler (fluorescein & grønt fluoriserende protein (GFP)) og lipid membraner (perylen og DiI). Grønt fluoriserende protein er taget fra PDB fil 1GFL.

 

Ulempen ved anvendelse af visse organiske fluoroforer kan være tab af fluorescens over tid – et fænomen der kendes som fotoblegning. Dette skyldes fluoroforen bliver overeksponeret af det lys, der anvendes til at få dem til at fluorescere med. Denne ulempe ved de organiske fluoroforer begrænser den tidsperiode, hvori man kan undersøge sin prøve uden at miste fluorescens intensitet. En måde at overkomme dette problem på er ved anvendelse af de såkaldte Quantum Dots – en nanokrystal lavet af halvledere – hvilke ikke fotobleger nær så hurtigt, som konventionelle fluoroforer. I forhold til organiske fluoroforer afhænger emmisionsbølgelængden ikke af strukturen af en Quantum Dot, men af dens størrelse. Små Quantum Dots vil derfor udsende lys i det blå område, hvorimod store Quantum Dots udsender lys i det røde område af det synlige spektrum. Denne effekt skyldes kvantemekanik, og vil ikke blive gennemgået her, men ved at ændre størrelsen af en Quantum Dot kan man stort set designe den til at have den ønskede emmisionsbølgelængde. Selvom Quantum Dots har en række overlegne egenskaber i forhold til konventionelle organiske fluoroforer har de selv den ulempe at de blinker, hvilket kan være en ulempe, hvis man vil følge en Quantum Dots bevægelse.

Memphys, Center for biomembranfysik, Syddansk Universitet Campusvej 55 DK-5230 Odense M

Copyright @ All Rights Reserved